Specifika histologiska analys eller
färgningsmetoder
används för att identifiera och lokalisera
specifika celler, cellstrukturer eller enskilda komponenter i
celler. Metoderna kan användas för att studera celler i
vävnader i form av
vävnadssnitt eller hela bitar av
vävnader eller tom hela organismer (sk
"whole mount"). Metoderna kan
också användas för att studera celler i kultur.
De kanske mest använda metoderna är
in situ hybriserings- och
immunohistokemi. Metoderna
identifierar och visualiserar förekomsten av specifika
molekyler i vävnader. In situ hybridiseringshistokemi
(cytokemi) bygger på detektionen av nukleinsyra och baseras
på specifik hybridisering mellan cellulärt RNA eller
DNA och en inmärkt nukleinsyra probe. Immunohistokemi
(cytokemi) bygger på att specifika märkta antikroppar
känner igen sitt antigen i cellerna.
Fixering
De flesta histologiska metoderna kräver att vävnaden
som skall analyseras fixeras innan analysen utförs.
Fixeringen sker för att bevara
vävnadens naturliga struktur och form samt för att
molekyler ej skall förloras från vävnaderna i
senare steg, tex tvättning.
Man använder kemikalier som stabiliserar och korsbinder
vävnader som fixeringsmedel. Den vanligaste kemikalien
är paraformaldehyd (PFA). PFA används ofta som en 4%
lösning i fosfatbuffert pH=7,5. PFA är en aldehyd och
det är aldehydgruppens reaktivitet som man använder
för att korsbinda vävnaderna. Andrafixeringsmedel
är glutaraldehyd, formaldehyd, ättiksyra/myrsyra,
picrinsyra och metanol.
Det finns två fixeringsmetoder:
- Immersionsfixering.
Vävnaden dissikeras ut och doppas ner i fixeringsmedlet
som får tränga in i vävnadsbiten varvid
fixeringen sker.
- Perfusionsfixering. Innan
vävnaden dissikeras ut så genomspolas (perfunderas)
djuret med fixeringsmedlet genom att ansluta en kanyl till
vänster kammare i hjärtat. Vävnaden fixeras
innifrån och är effektiv. Djuret skall vara
terminalt sövt och avlider direkt vid behandlingen.
Perfusionsfixering följs ofta av att de dissikerade
vävnadsbitarna immersionfixeras.
Fördelarna med perfusionsfixering är att den
naturliga strukturen på vävnaden bevaras.
Snittning
För att kunna studera vävnaderna behövs i de
flesta fall vävnaderna skäras i tunna snitt. Det finns
olika hjälpmedel för att göra snitten. Vanligast
är att man använder en vibratom, mikrotom eller
kryotom.
- Vibratomen kan användas
för att snitta vävnaden direkt. Metoden används
när man vill ha lite tjockare snitt 20-200 µm
tjocka.
- Mikrotomen används
för att snitta tunna snitt, 2-20 µm tjocka. För
att kunna göra tunna snitt behöver vävnaden
bakas in i något ämne som stöttar upp
vävnaden vid själva snittningen. Vanligen
används paraffin eller någon plast (epoxi).
- Ultramikrotom används för att snitta ultratunna
snitt 0,1-2 µm tjocka och kräver plastinbäddning
av vävnaden.
- Kryotomen används
för att snitta frusen vävnad. Mindre
vävnadsbitar brukar man bädda in i ett frysmediium
som man kan snitta genom för att undvika att bitarna bryts
sönder.
Innan man snittar vävnaderna behöver man oftast
montera dem i ett inbäddningsmedium.
Inbäddning och kryobehandling
Vävnader som skall snittas,
bäddas in i ett
inbäddningsmedium före snittning. Inbäddningsmedier
är fasta vid rumstemperatur eller då de fryser så
att de kan snittas i en mikrotom eller kryotom. Vävnaden
bakas in i inbäddningsmediumet som stöttar upp
vävnaden och cellerna mekaniskt vid själva snittningen.
Inbakningen underlättar också
monteringen av vävnaden i
mikrotomen så att man kan få det snitt-plan genom
vävnaden som man vill studera.
Paraffin och plastinbäddning: Vanligen
används paraffin eller
någon tvåkomponent
epoxiplast som
inbäddningsmedium. Det är viktigt att
inbäddningsmediumet tränger in i vävnaden och
fyller ut alla celler för att resultatet skall bli bra.
Vävnaderna dehydreras först (vatten tas bort) varefter
vävnaderna behandlas med olika lösningsmedel för
att föra in inbäddningsmediumet. Förfarandet
varierar mellan olika medium. Vävnadsbiten placeras slutligen
i en form och gjuts in i inbäddningsmedium som stelnar och
är därmed färdig att snittas. Denna typ av
inbäddning bevarar formen (morfologin) hos vävnaden och
cellerna på ett ypperligt sätt men kan påverka
antigen och proteiner genom behandlingarna med
lösningsmedel.
Frysinbäddning och kryobehandling: När
vävnader fryser bildas iskristaller som förstör
cellerna. För att motverka att cellerna går sönder
vid frysningen behandlas vävnaden med glycerol eller suckros
(kryobehandling). Vanligtvis
gör man en treskalig behandling med 10, 20 och slutligen
30% suckros som biten får ligga
i tills suckrosen trängt in i cellerna (vävnaden
sjunker). Vävnadsbiten lägges sedan i frysmedium i en
form och fryses och är därmed färdig att snittas.
Denna typ av inbäddning och snittning är skonsam mot
cellerna och det är stor chans att en antikropp kommer
fungera att använda i en immunohistokemisk analys.
Det går att snitta vissa vävnader utan att
kryobehandla (färskfrusen vävnad). Vävnaden
får dock ej vara fixerad för att det skall fungera.
Snittning av färskfrusen vävnad kan bara användas
för analyser som använder icke-fixerad vävnad (tex.
oligonukleotid-baserad in situ hybridisering).
Snittning och uppsamling av vävndassnitt för
analys
Vävnadssnitten förs över från kniven till
objektglas. Det finns olika metoder för att sträcka ut
och att få snitten att fastna på objektglasen.
Paraffinsnitt låter man sträcka ut på en varm
vatten yta innan de fästs på ett objektglas medans
kryosnitt kan fästas direkt på ett rumstempererat
objektglas.
Vävnadsefterbehandling
Rester av inbäddningsmedium i snitt och på glas
avlägsnas genom behandling med olika lösningsmedel.
Paraffin avlägsnas med lösningsmedlet xylen eller
Histoclear (apelsinolja). Snitten rehydreras (vatten
tillförs) genom att stegvis öka vattenhalten i en
etanol/vatten blandning. Vidare efterbehandling kan ske på
olika sätt efter behov och protokoll. Vanliga typer av
efterbehandling är behandling med detergent (Triton-X100)
för att luckra upp cellmemebranen eller Proteinas-K för
att luckra upp bindvävsstrukturer mm.
Snitten inkuberas sedan i buffert (ofta PBS) för att
tvätta och jämvikta vävnaden med buffert innan
själva analysen utförs.
Överst på sidan. Tillbaka
till indexsidan
